自2012年6月CRISPR-Cas9技術誕生以來，這項被稱為“基因剪刀”的革命性技術已應用于植物育種、癌癥治療等多個領域，成為全球實驗室里最風靡的基因編輯技術。它還斬獲了2020年諾貝爾化學獎。

“CRISPR-Cas系統是微生物中廣泛存在的抗病毒免疫系統——約90%的古菌和40%的細菌基因組中都存在這一系統。”中國科學院微生物研究所(以下簡稱微生物所)研究員向華在接受《中國科學報》采訪時說。那么，這一系統是如何在微生物中廣泛存在并發揮作用的?是否有一些“暗物質”在維持這一系統的穩定性?

經過近7年的研究，向華與微生物所研究員李明及合作者找到了保護微生物CRISPR-Cas系統的“暗物質”。相關研究論文近日發表于《科學》。

微生物免疫“分子警察”

“實際上，‘基因剪刀’這一革命性的生物技術起源于科學家對微生物中一種特殊的免疫系統的研究，即CRISPR-Cas。”該論文共同第一作者兼通訊作者李明對《中國科學報》說。

據介紹，CRISPR-Cas系統是在微生物中廣泛存在的抗病毒(噬菌體)免疫系統。宿主菌通過將入侵病毒的特定DNA序列插入到其CRISPR結構中，可形成對該病毒的永久性“記憶”。這些記憶性DNA序列可經轉錄加工產生小分子RNA。它們攜帶了病毒的序列信息，能夠指導CRISPR效應蛋白(如Cas9蛋白、Cascade蛋白復合物)特異性識別和切割再次入侵的病毒DNA，實現對該病毒的適應性免疫。

“如果將CRISPR結構比作記錄了病毒DNA這種‘犯罪分子’信息的檔案庫，那么CRISPR效應蛋白就像一些‘分子警察’，手持寫有病毒序列特征的批捕文件(crRNA)，在細胞內尋找并消滅‘犯罪分子’(病毒DNA)。”李明解釋說。

對此，向華表示，CRISPR-Cas系統的維持和表達往往消耗大量的物質和能量，給宿主細胞造成一定的負擔，同時它也有發生“自免疫”的風險，即殺死宿主細胞。因此，在進化過程中，細菌可能會丟棄這個系統。

那么，是什么導致CRISPR-Cas系統在微生物中具有廣泛的穩定性呢?這是微生物學家長期關注卻尚未充分回答的前沿科學問題。

經過反復的猜測和試錯驗證，研究團隊發現，“保護”微生物CRISPR-Cas系統的“暗物質”是一對RNA分子。

“自私”的護衛

向華和李明團隊是國內較早從事CRISPR免疫機制研究的團隊。早在2014年，他們利用一株名為西班牙鹽盒菌的古菌及其病毒，系統解析了CRISPR高效獲取病毒DNA序列信息的分子機制。

研究過程中，他們發現了一個奇怪的現象——CRISPR效應蛋白的編碼基因(Cas5/6/7/8)無法逐一敲除，但可以作為整體一起敲除，從而推測“分子警察”Cas的基因簇中可能隱藏了一個“細胞成癮”元件。“也就是說，有一些‘暗物質’讓細胞對CRISPR-Cas蛋白上癮，沒有這些蛋白，宿主細胞就會‘癮發身亡’。”李明解釋說。

為查明“暗物質”的身份，他們經過近7年的探索，在Cas的基因簇附近發現了一類由兩個小RNA組成的全新的毒素—抗毒素系統，并將兩個小RNA分別命名為毒素(CreT)和抗毒素(CreA)。他們發現這一對神秘小RNA通過一系列十分精巧的分子機制守護了CRISPR-Cas系統的結構和功能。

“我們發現，當毒素—抗毒素系統與CRISPR-Cas偶聯存在時，Cas效應蛋白可以和抗毒素共同抑制毒素的表達，而一旦Cas效應蛋白被破壞，就會釋放毒素并殺死細胞。”李明說。

他進一步解釋，這說明CRISPR-Cas系統效應蛋白在細胞中具有雙重生理功能。它們一部分扮演著“分子警察”的角色，攜帶寫有病毒序列信息的批捕文件，尋找入侵的病毒DNA并將其消滅;而另一部分效應蛋白則手持“抗毒素”控制器，守護在定時炸彈“毒素”基因旁邊，一旦CRISPR-Cas系統丟失或被病毒破壞，它們就引爆炸彈，炸毀細胞中關鍵的蛋白質合成機器，使細胞休眠甚至死亡。

“CRISPR系統的這種貌似‘自私’的特性，使我們能夠從更高維度上認識微生物的免疫策略。”向華補充說。在自然界中，微生物往往以群體的形式存在，當某個細胞的CRISPR系統被病毒破壞時，很容易淪為病毒大量復制和增殖的病毒工廠，可以產生成百上千的子代病毒侵染群體中的其他細胞。而當CRISPR內置了毒素—抗毒素RNA系統，一旦CRISPR效應物被病毒破壞，它就會毀掉病毒復制和增殖所必需的細胞機器，從而保護群體中其他細胞不被侵染，因此，這是一種利他主義的群體防御策略。

“這項研究中描述的發現無疑是新奇而有趣的。”一位審稿人在評議時表示。其他審稿人也認為，“這絕對是一項好研究”“代表了一個令人興奮的發現和令人信服的想法”。

打開了解RNA“暗物質”新窗口

據該論文共同第一作者、微生物所博士后龔路遙介紹，此前，科學家已發現6類毒素—抗毒素分子對，其中毒素均為蛋白質。這是研究人員首次在RNA層面發現毒素和抗毒素分子對。

“由于缺乏保守的序列特征，非編碼RNA的預測和功能研究是非常困難的。但實際上越來越多證據表明，非編碼RNA在細胞生命活動中發揮了非常重要的作用。”龔路遙說，這些RNA被稱為基因組中的“暗物質”。

該團隊還發現，在不同古菌、細菌不同類型的CRISPR-Cas系統中，存在的毒素—抗毒素類似物在序列上非常豐富多樣，蘊藏了大量未知機制的功能性小RNA。“這將為原核微生物‘非編碼RNA暗物質世界’的研究打開一扇寶貴的窗口。對這些豐富多樣的‘暗物質’的深入發掘將進一步推動生物技術的發展，例如對于小RNA腫瘤藥物、新型抗生素的研制等，或將具有重要的啟發意義。”向華說。

“這是一項十分優秀的研究，即使在CRISPR領域之外也很重要，有助于我們理解病毒防御和基因調控的共進化這一重要命題。”美國國立衛生研究院生物技術信息中心教授Eugene Koonin說。

標簽： “基因剪刀”